Construção de modelo in vitro baseados em edição gênica por CRISPR/cas9 no LDLR visando melhor compreensão da influência genética na hipercolesterolemia familial (2023)
- Authors:
- Autor USP: MORI, AUGUSTO AKIRA - FCF
- Unidade: FCF
- Sigla do Departamento: FBC
- DOI: 10.11606/T.9.2023.tde-12122023-113730
- Subjects: HIPERCOLESTEROLEMIA; ANÁLISE FUNCIONAL
- Keywords: CRISPR; CRISPR/Cas9; Familial Hypercholesterolemia; Functional Analyses; Hipercolesterolemia Familial; LDLR; LDLR
- Agências de fomento:
- Language: Português
- Abstract: A Hipercolesterolemia Familial (HF) é uma das principais causas de doenças cardiovasculares, sendo causado principalmente por variantes genéticas no gene do Receptor de Lipoproteínas de Baixa Densidade (LDLR). Apesar das tecnologias de sequenciamento de próxima geração (NGS) serem capazes de identificar diversas variantes, poucas delas foram funcionalmente caracterizadas. A utilização da ferramenta de edição gênica CRISP/Cas9 promove uma edição gênica precisa e permite a criação de modelos experimentais, de forma a contribuir para a melhor validação funcional dessas variantes. O objetivo deste trabalho foi realizar a avaliação funcional de variantes do LDLR identificadas em portadores de HF, através da utilização de CRISPR/Cas9.: Baseado em análises de predição in sílico, do domínio afetado da proteína e na frequência da variante na população, selecionou-se três variantes do LDLR (rs5928 c.2441G>A p.Arg814Gln; rs750518671 c.2389 G>C p.Val797Leu e rs879254797 c.1118G>A p.Gly373Asp), e construiu-se três sgRNAs para cada um deles. Os sgRNAs foram inseridos no plasmídeo PX458 previamente digerido com a enzima de restrição BbsI, clonados e purificados em bactérias E. coli DH5α, e co-transfectados com os seus respectivos moldes de reparo de DNA em células HepG2. As células co-transfectadas foram isoladas por FACS, e colocadas em cultura para crescimento e posterior avaliação funcional. A expressão de LDLR foi avaliada por citometria de fluxo utilizando-se anticorpo anti-LDLR conjugado com Alexa Fluor-647, e por Western Blotting. A análise de atividade do LDLR foi realizada por citometria de fluxo utilizando-se anticorpo anti-LDLR e Dil-LDL. Realizou-se também análises de microscopia confocal e por microscopia em campo claro utilizando-se marcação com Oil Red O para avaliação da atividade das células cotransfectadas. As variantes foram também analisaanalisadas por docking molecular para avaliar o efeito das variantes. Análises funcionais das células HepG2 editadas revelaram menores índices tanto de expressão quanto de ligação a partícula de LDL e internalização do complexo LDLR-LDL, para as três variantes estudadas. A análise de docking molecular para a variante rs879254797 revelou que a troca de um Asp por um Gly na posição 373 diminui a distância de interação entre o LDLR e a ApoB, aumentando a força de interação do complexo e diminuindo o processo de reciclagem do receptor de volta para a membrana. Além disso, verificou-se por microscopia, a ocorrência de processos celulares como comunicação célula-célula e formação de pseudópodes para captura de LDL nas células co-transfectadas com essa variante. Para a variantes rs750518671 c.2389 G>C p.Val797Leu, além da menor expressão, ligação e internalização do complexo LDLR-LDL, observouse também a formação de vacuolização e deposição de lipídeos. Conclui-se com este estudo que, apesar das variantes rs5928 c.2441G>A p.Arg814Gln e rs750518671 c.2389G>C p.Val797Leu terem sido associadas a alterações no processo de ancoramento do receptor a membrana, os resultados9 demonstraram que estas variantes também apresentam efeito patogênico devido aos baixos níveis de expressão, de ligação à LDL e de internalização do complexo LDLR-LDL, que foram refletidos nos fenótipos dos pacientes
- Imprenta:
- Data da defesa: 25.09.2023
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- Cor do Acesso Aberto: gold
- Licença: cc-by-nc-sa
-
ABNT
MORI, Augusto Akira. Construção de modelo in vitro baseados em edição gênica por CRISPR/cas9 no LDLR visando melhor compreensão da influência genética na hipercolesterolemia familial. 2023. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2023. Disponível em: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9136/tde-12122023-113730/. Acesso em: 24 maio 2024. -
APA
Mori, A. A. (2023). Construção de modelo in vitro baseados em edição gênica por CRISPR/cas9 no LDLR visando melhor compreensão da influência genética na hipercolesterolemia familial (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, São Paulo. Recuperado de https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9136/tde-12122023-113730/ -
NLM
Mori AA. Construção de modelo in vitro baseados em edição gênica por CRISPR/cas9 no LDLR visando melhor compreensão da influência genética na hipercolesterolemia familial [Internet]. 2023 ;[citado 2024 maio 24 ] Available from: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9136/tde-12122023-113730/ -
Vancouver
Mori AA. Construção de modelo in vitro baseados em edição gênica por CRISPR/cas9 no LDLR visando melhor compreensão da influência genética na hipercolesterolemia familial [Internet]. 2023 ;[citado 2024 maio 24 ] Available from: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9136/tde-12122023-113730/ - Atividade virucida de EPI com impregnação de prata: validação in vitro
- PVC containing silver nanoparticles with antimicrobial properties effective against SARS-CoV-2
- Effects of LDLR variants rs5928, rs750518671 and rs879254797 on protein structure and functional activity in HepG2 cells transfected with CRISPR/ Cas9 constructs
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Informações sobre o DOI: 10.11606/T.9.2023.tde-12122023-113730 (Fonte: oaDOI API)
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