PCR em tempo real na detecço e discriminação de Aspergillus fumigatus, Rhizopus arrhizus e Fusarium solani em biópsias obtidas de infecções invasivas em modelo experimental murino (2018)
- Authors:
- Autor USP: FELIX, GABRIEL NAVES - FM
- Unidade: FM
- Sigla do Departamento: MDT
- Subjects: MICOSES; ASPERGILLUS; ASPERGILOSE ANIMAL; ROEDORES; REAÇÃO EM CADEIA POR POLIMERASE; BIÓPSIA; CAMUNDONGOS DE CEPAS ENDOGÂMICAS
- Keywords: Biopsy; Invasive fungal infections; Mice; Mucorales; Mucorales; Pathology; Polymerase chain reaction; Real-time polymerase chain reaction
- Language: Português
- Abstract: Nas últimas décadas, tem sido relatado o aumento de casos de infecções fúngicas invasivas por agentes oportunistas, tais como Aspergillus spp., Fusarium spp. e fungos da ordem Mucorales, em pacientes hospitalizados, particularmente os imunocomprometidos. Como os sintomas são frequentemente inespecíficos, esses patógenos não são identificados inicialmente como agentes causais. Além disso, muitas vezes o diagnóstico só é estabelecido em estágios tardios da infecção, pois as metodologias diagnósticas de rotina, como cultura e microscopia, apresentam limitações caracterizadas, sobretudo, por baixa sensibilidade e especificidade. Os métodos moleculares, incluindo as amplificações de material genômico por PCR, em tecidos a fresco e parafinados, têm sido mais aplicados para a melhoria na detecção e identificação desses patógenos. A técnica de PCR em tempo real apresenta a vantagem de fornecer resultados com rapidez e elevada sensibilidade, além de minimizar os riscos de contaminação ambiental das amostras. Para aprimorar o conhecimento sobre a eficácia desta técnica na detecção e identificação dos patógenos, neste estudo foram utilizados camundongos da linhagem BALB/c para o desenvolvimento de modelos de infecção invasiva por Aspergillus fumigatus, Rhizopus arrhizus e Fusarium solani. Após inoculação dos fungos por via intravenosa, os órgãos (pulmão, fígado, rins, cérebro e coração) foram retirados para realização dos exames de cultura, histopatologia, PCR semi-nested e PCR emtempo real. As culturas foram realizadas em ágar Sabouraud dextrose e incubadas por 3 a 5 dias à temperatura ambiente. Para as análises histopatológicas, uma parte dos órgãos foi emblocada em parafina e cortes foram submetidos às colorações por hematoxilina-eosina e Gomori-Grocott. Para as análises moleculares, foram realizadas clonagens dos amplicons obtidos com os mesmos primers gênero-específicos (Aspergillus spp. e Fusarium spp.) e ordem-específicos (mucoráceos) empregados nas reações de PCR. Os clones foram empregados na técnica de PCR em tempo real para avaliação da sensibilidade analítica dos ensaios e como controles positivos. Os tecidos a fresco e parafinados foram submetidos a extrações de DNA, e as amostras foram avaliadas por PCR do tipo semi-nested, e por PCR em tempo real, empregando-se os primers gênero e ordem-específicos. Após 48-72 horas, observou-se crescimento fúngico nas culturas, porém a identificação macroscópica foi possível somente após 96 horas. Nos exames histopatológicos foram observadas presença de estruturas fúngicas e alterações na morfologia tecidual, confirmando a disseminação da infecção nos três modelos experimentais. Os dois métodos de PCR (convencional e tempo real) empregando os primers para Aspergillus e mucoráceos demonstraram 100% de especificidade. Além disso, os primers para mucoráceos amplificaram amostras de DNA dos gêneros Rhizopus, Mucor e Lichtheimia, confirmando serem ordem-específicos. Por outro lado, os testes molecularescom emprego de diversos primers de Fusarium apresentaram reatividade cruzada, principalmente com amostras de DNA de Aspergillus e Rhizopus. O limiar de detecção (LD) das PCR semi-nested para Aspergillus e Rhizopus foi de 50 fentogramas de DNA, enquanto na PCR em tempo real o LD foi de 20 fentogramas de DNA e 2x102 plasmídios/ul. Os dois métodos moleculares detectaram DNA de Aspergillus e Rhizopus, em 100% das amostras de tecido a fresco e parafinado, corroborando com os resultados de cultura e histopatologia. Os resultados do estudo demonstraram que a PCR em tempo real foi capaz de detectar e diferenciar Aspergillus e Rhizopus nos tecidos a fresco e parafinados, com 100% de especificidade e maior sensibilidade analítica quando comparada à PCR semi-nested. Entretanto, os resultados obtidos com diversos primers de Fusarium utilizados nos ensaios de PCR foram inconsistentes em relação à especificidade das amplificações. A PCR em tempo real constituiu um método rápido para diagnosticar, com acurácia, aspergilose e mucormicose em tecidos, podendo ser implementada como alternativa na rotina diagnóstica de laboratórios de patologia ou microbiologia. Por outro lado, a técnica apresentou baixa especificidade com os primers de Fusarium selecionados neste estudo. Outras sequências gênicas deste fungo deverão ser avaliadas na técnica molecular para se atingir resultados precisos
- Imprenta:
- Data da defesa: 26.10.2018
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ABNT
FELIX, Gabriel Naves. PCR em tempo real na detecço e discriminação de Aspergillus fumigatus, Rhizopus arrhizus e Fusarium solani em biópsias obtidas de infecções invasivas em modelo experimental murino. 2018. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2018. Disponível em: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/5/5133/tde-15012019-092753/. Acesso em: 23 maio 2024. -
APA
Felix, G. N. (2018). PCR em tempo real na detecço e discriminação de Aspergillus fumigatus, Rhizopus arrhizus e Fusarium solani em biópsias obtidas de infecções invasivas em modelo experimental murino (Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo, São Paulo. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/5/5133/tde-15012019-092753/ -
NLM
Felix GN. PCR em tempo real na detecço e discriminação de Aspergillus fumigatus, Rhizopus arrhizus e Fusarium solani em biópsias obtidas de infecções invasivas em modelo experimental murino [Internet]. 2018 ;[citado 2024 maio 23 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/5/5133/tde-15012019-092753/ -
Vancouver
Felix GN. PCR em tempo real na detecço e discriminação de Aspergillus fumigatus, Rhizopus arrhizus e Fusarium solani em biópsias obtidas de infecções invasivas em modelo experimental murino [Internet]. 2018 ;[citado 2024 maio 23 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/5/5133/tde-15012019-092753/
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